Florey werd geboren in Adelaide, Zuid-Australië, als zoon van een schooldirecteur. Hij studeerde aan het St Peter's College, Adelaide en de Universiteit van Adelaide, waar hij in 1921 afstudeerde met een Bachelor of Science-graad en in 1924 een Doctor of Medicine-graad.
Na het behalen van zijn medische opleiding werkte Florey bij het Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research in Melbourne, waar hij Ernst Chain ontmoette. In 1928 verhuisden ze naar de Sir William Dunn School of Pathology aan de Universiteit van Oxford, waar ze begonnen te werken aan de ontwikkeling van penicilline.
Penicilline was in 1928 ontdekt door Alexander Fleming, maar was nog niet tot een bruikbaar medicijn ontwikkeld. Florey en Chain slaagden erin de werkzame stof van penicilline te isoleren en te zuiveren, zodat deze bij patiënten kon worden geïnjecteerd. Ze ontwikkelden ook methoden voor de massaproductie van penicilline, waardoor het tijdens de Tweede Wereldoorlog op grote schaal kon worden gebruikt.
Het werk van Florey en Chain op het gebied van penicilline redde talloze levens tijdens de Tweede Wereldoorlog en bracht een revolutie teweeg in de behandeling van infectieziekten. Florey ontving in 1945 de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde en werd in 1944 tot ridder geslagen.
Florey was ook een vooraanstaand bestuurder en opvoeder. Hij was van 1959 tot 1962 vice-kanselier van de Universiteit van Oxford en van 1960 tot 1965 voorzitter van de Royal Society of London. Hij was ook een Fellow van de Australian Academy of Science, de American Academy of Arts and Sciences. en de Nationale Academie van Wetenschappen.
Florey stierf in 1968 in Oxford aan een beroerte. Hij wordt beschouwd als een van de belangrijkste Australische wetenschappers van de 20e eeuw, en zijn werk aan penicilline heeft miljoenen levens gered.