Onbeantwoorde liefde is een terugkerend thema in het stuk, aangezien verschillende personages verliefd zijn op iemand die hun genegenheid niet beantwoordt. Viola is bijvoorbeeld verliefd op hertog Orsino, die verliefd is op Olivia. Olivia is op haar beurt verliefd op Cesario (die eigenlijk vermomde Viola is). Hierdoor ontstaat een complex web van onbeantwoorde liefde dat een groot deel van de actie en humor van het stuk aanstuurt.
Een verkeerde identiteit is ook een belangrijk kenmerk van het stuk. Viola vermomt zichzelf als een man genaamd Cesario om in dienst van Orsino te komen. Deze vermomming leidt tot een aantal misverstanden en complicaties, omdat andere personages Viola voor een man aanzien en verliefd op haar worden. De verkeerde identiteit creëert ook kansen voor Viola om de andere personages te observeren en erop te reageren, wat bijdraagt aan de humor van het stuk.
Over het geheel genomen zijn onbeantwoorde liefde en identiteitsverwisseling twee belangrijke kenmerken die bijdragen aan de humor en complexiteit van Twelfth Night.