Hoofdpersonen:
* Sherlock Holmes: De briljante detective, bekend om zijn deductieve redeneer- en observatievaardigheden.
* Dr. John H.Watson: Holmes' trouwe vriend en kroniekschrijver, die vaak als standpunt van de lezer fungeert.
* Mary Morstan: Een jonge vrouw die informatie zoekt over de verdwijning van haar vader en het mysterieuze "Sign of Four" dat ze ontvangt.
* Jonathan Klein: Het gemene, maar uiteindelijk tragische brein achter de diefstal van de Agra-schat en het 'Sign of Four'.
* Thaddeus Sholto: Jonathan Small's voormalige partner in crime, die een deel van de Agra-schat erft. Hij wordt vermoord voordat het verhaal begint.
* Athelney Jones: Een detective van Scotland Yard, vaak belachelijk gemaakt door Holmes vanwege zijn overdreven methodische en minder intuïtieve aanpak.
Andere belangrijke karakters:
* Mevr. Hudson: De hospita van 221B Baker Street, waar Holmes en Watson wonen.
* De Tonga-stam: Een groep inboorlingen van de Andaman-eilanden, loyaal aan Jonathan Small en voerde zijn plannen uit.
* Het "teken van vier": De naam die aan vier unieke voorwerpen wordt gegeven:een zilveren speld, een klein, versierd doosje, een stuk loden pijp en een hondenhalsband. Deze items worden in verband gebracht met de diefstal van de Agra-schat.
Ondersteunende personages:
* Bartholomeus Sholto: De broer van Thaddeus, die een deel van de Agra-schat erft en een doelwit wordt voor Jonathan Small.
* Mevr. Sholto: De moeder van Thaddeus en Bartholomeus, die zich zorgen maakt over hun veiligheid.
* Mevrouw. Morstan (Mary's moeder): Een vrouw die ooit verliefd was op Thaddeus Sholto en die onder mysterieuze omstandigheden stierf.
* Inspecteur Bradstreet: Een Scotland Yard-inspecteur die samenwerkt met Athelney Jones.
Het is belangrijk om te onthouden dat hoewel het verhaal zich voornamelijk op de hoofdpersonen concentreert, veel ondersteunende personages lagen aan de plot toevoegen en bijdragen aan de algehele sfeer van de roman.