* De veronderstelling dat alle karakters heteroseksueel zijn. Dit komt duidelijk tot uiting in de manier waarop de personages over liefde en relaties praten, en in de manier waarop ze met elkaar omgaan. Als Viola zich bijvoorbeeld als man vermomt, wordt er onmiddellijk aangenomen dat ze verliefd is op Orsino, ook al heeft ze hem nog nooit ontmoet.
* De weergave van het verlangen naar hetzelfde geslacht als onnatuurlijk of komisch. Dit is het duidelijkst te zien in het karakter van Sir Andrew Aguecheek, die voortdurend grappen maakt over zijn aantrekkingskracht op mannen. Zijn verlangen wordt door niemand serieus genomen en hij wordt er vaak belachelijk om gemaakt.
* Het feit dat het stuk eindigt met een traditioneel heteroseksueel huwelijk. Dit versterkt het idee dat heteroseksualiteit de enige aanvaardbare vorm van seksuele geaardheid is.
De uitdrukking van heteronormativiteit in Twelfth Night is problematisch omdat niet-heteroseksuele mensen hierdoor worden gemarginaliseerd en uitgesloten. Het creëert ook een klimaat waarin het voor niet-heteroseksuele mensen moeilijk is om open te zijn over hun seksuele geaardheid.