De regel "Slaap niet meer!" heeft verschillende betekenislagen in het stuk. Op één niveau is het eenvoudigweg Macbeths bevel aan het hele huishouden om wakker te blijven en alert te zijn, omdat hij vreest dat er iets mis is gegaan. De zin heeft echter ook diepere betekenissen en is een voorbode van de komende gebeurtenissen.
Ten eerste de regel "Slaap niet meer!" kan worden gezien als een metafoor voor het verlies van onschuld en het begin van Macbeths afdaling in de duisternis. Tot dit punt in het stuk worstelt Macbeth met zijn geweten en heeft hij spijt getoond van zijn daden. Door echter de zin "Slaap niet meer!" uit te spreken, verdrijft hij feitelijk de slaap en daarmee elke kans op verlossing. Deze lijn markeert een keerpunt in Macbeths karakter en symboliseert zijn omarming van het kwaad.
Ten tweede, de regel "Slaap niet meer!" is een krachtige vloek die Macbeth over zichzelf en het hele huishouden uitspreekt. Door zichzelf en de anderen het vermogen om te slapen te ontzeggen, creëert Macbeth een staat van voortdurende onrust en angst. Slaap wordt vaak geassocieerd met vrede, herstel en het onderbewustzijn, en door zichzelf daarvan te beroven, bereidt Macbeth het toneel voor de mentale en emotionele onrust die zal volgen. De zinsnede suggereert dus dat er geen uitstel zal zijn van de schuldgevoelens, angst en paranoia die Macbeth ervaart.
Ten derde, de regel "Slaap niet meer!" voorafschaduwt de verontrustende episode van slaapwandelen die Lady Macbeth later in het stuk zal meemaken. Terwijl Macbeth steeds meer door zijn schuldgevoel wordt verteerd, begint Lady Macbeth last te krijgen van slaapwandelen en nachtmerries, waarin ze voortdurend de zinsnede "Out, verdomde plek!" herhaalt. (Act 5, Scène 1). Deze zin weerspiegelt in zekere zin het eerdere bevel van Macbeth en benadrukt de slapeloosheid en mentale angst waarmee het echtpaar is geconfronteerd.
Tot slot de regel "Slaap niet meer!" is een cruciaal moment in Macbeth dat de transformatie van Macbeth in een meedogenloos en schuldig individu markeert. Het fungeert als een metafoor voor het verlies van onschuld, een krachtige vloek en een voorbode van de toekomstige rampen die Macbeth en de mensen om hem heen te wachten staan.